AAV(아데노연관바이러스) 패키징에서의 일반적인 문제

1. 낮은 바이러스 수율 (Low Yield)

일반적인 원인:

• 트랜스펙션 효율 낮음: 플라스미드 비율이 맞지 않거나 DNA 품질이 낮고, 트랜스펙션 시약이 적합하지 않아서 발생할 수 있습니다.

• 세포 상태 불량: HEK293T 세포가 최적의 성장 단계에 있지 않거나 과도하게 융합된 경우.

• 생산 시스템 부적합: Helper와 RepCap 플라스미드 비율이 맞지 않음.

해결 방법:

• 세포의 건강 상태를 유지하고, 70–80% 융합 상태에서 트랜스펙션을 진행합니다.

• 고품질의 플라스미드를 사용하고, DNA 순도를 보장합니다.

• 트랜스펙션 시스템을 최적화하고, 플라스미드 비율을 적절히 조정합니다.

• 필요시 다른 패키징 시스템을 사용하거나 트랜스펙션 시약을 변경합니다.

2. 낮은 타이터 (Low Titer)

일반적인 원인:

• 바이러스 입자 포장 효율 낮음: 유전자 장착이 불완전하거나 빈 캡시드가 많음.

• 수집 시간 부적합: 바이러스가 배양액에서 너무 오랫동안 방치되어 바이러스 활성이 떨어짐.

• 세포의 사망률이 너무 높음: 과도한 세포 손상으로 바이러스 수율이 감소할 수 있습니다.

해결 방법:

• 적절한 수집 시간을 선택합니다. 일반적으로 48시간과 72시간이 가장 효과적입니다.

• 바이러스를 농축하기 위해 PEG 침전법이나 초속도 원심분리를 사용합니다.

• 패키징 플라스미드 시스템을 최적화합니다.

3. 순도 낮음 (Impurities)

일반적인 원인:

• 바이러스 입자가 불순물로 오염됨: 상등액에 세포 파편, 단백질, DNA가 섞여 있을 수 있습니다.

• 정제 방법이 부적합: 적절한 정제 방법이 사용되지 않으면 불순물이 제거되지 않을 수 있습니다.

해결 방법:

• 상등액을 수집한 후 0.45 µm 여과막을 통해 필터링합니다.

• 초속도 원심분리 또는 아이오딕사놀(Iodixanol) 밀도 균등화 원심분리를 사용하여 바이러스를 정제합니다.

• 상등액을 필터링하고 무균 작업을 철저히 합니다.

4. 빈 캡시드 비율 높음 (High Empty Capsids)

일반적인 원인:

• 포장 시스템 문제: RepCap과 GOI 플라스미드의 비율이 적절하지 않음.

• 포장 효율이 낮음: 유전자 장착이 불완전하거나 세포가 분해되는 과정에서 바이러스가 손실됨.

해결 방법:

• RepCap과 GOI 플라스미드의 비율을 조정합니다

• 패키징 시스템을 최적화하여 빈 캡시드 비율을 줄입니다.

• 밀도 균등화 원심분리를 사용하여 빈 캡시드와 완전 캡시드를 분리합니다.

5. 감염 효율 낮음 (Low Transduction Efficiency)

일반적인 원인:

• 세포 유형 불일치: 특정 AAV 혈청형이 특정 세포 유형에 대해 감염 효율이 낮음.

• MOI(Multiplicity of Infection)가 낮음: 감염 수치가 낮으면 감염 성공률이 낮습니다.

• 수용체 부족: 일부 세포는 AAV가 결합할 수 있는 수용체가 부족할 수 있습니다.

해결 방법:

• 적합한 AAV 혈청형을 선택합니다. 예를 들어, AAV2, AAV8, AAV9 등은 다양한 조직에 적합합니다.

• MOI를 높여 감염 효율을 향상시킵니다.

• PolyBrene 등의 보조제를 사용하여 감염 효율을 향상시킵니다.

• 바이러스의 동결-융해를 피하고, 분할하여 보관합니다.

6. 세포 독성 (Cytotoxicity)

일반적인 원인:

• MOI가 너무 높음: 높은 MOI는 숙주 세포에 독성을 유발할 수 있습니다.

• 바이러스 포장 단백질 과발현: AAV의 Rep 및 Cap 단백질이 과도하게 발현되면 세포에 스트레스를 줄 수 있습니다.

해결 방법:

• MOI를 적절히 조정하고, 여러 번 나누어 감염합니다.

• 바이러스 포장 단백질의 발현을 적절하게 제한합니다.

• 감염 후 새 배양액으로 교체하여 세포 스트레스를 줄입니다.

7. 안전성 문제 (Safety Concerns)

일반적인 원인:

• AAV와 관련된 바이러스 유전자 시스템은 일정 수준의 재조합 위험을 내포하고 있습니다.

• 실험자 노출 위험: 잘못된 실험 절차로 실험자가 바이러스에 노출될 수 있습니다.

해결 방법:

• 생물안전 규정을 철저히 준수합니다.

• 제3세대 패키징 시스템을 사용하여 바이러스 기능을 여러 플라스미드로 분리함으로써 재조합 위험을 줄입니다.

• 실험자에게 적절한 생물안전 교육을 제공하고, 모든 실험은 BSL-2+ 또는 그 이상의 생물안전 수준에서 수행해야 합니다.

AAV 패키징에서 발생할 수 있는 일반적인 문제는 낮은 수율, 낮은 타이터, 순도 불량, 빈 캡시드 비율 높음, 감염 효율 저하, 세포 독성 및 안전성 문제입니다.
이 문제들을 해결하기 위해서는 트랜스펙션 조건 최적화, 플라스미드 비율 조정, 적합한 수집 및 정제 방법 사용, 바이러스 저장 방법 및 세포 건강 유지와 생물안전 규정 준수가 중요합니다.